近日，北京大学生态研究中心姚蒙课题组在国际生态环境高水平期刊Journal of Environmental Management发表题为“A large-scale comparative evaluation of DNA metabarcoding primers for profiling freshwater eukaryotic microalgal biodiversity”的研究论文。该研究围绕淡水真核藻类环境DNA（eDNA）监测中引物选择这一关键技术环节，系统评估93组针对18S rRNA基因不同区段的引物。该研究揭示模拟预测与实际扩增效果之间的差异，筛选出多组适用于藻类多样性监测的高性能通用引物，并显示不同参考数据库的分类注释效果差异明显，为基于eDNA技术的水生态藻类标准化监测提供重要的方法学依据。

真核微型藻类是淡水生态系统的关键初级生产者，也是评价水生态状况和水环境质量的重要生物指示类群。传统真核藻类调查主要依赖显微形态学鉴定，对分类经验要求高，时间成本高，在监测极小型、稀有种及复杂环境样本时存在一定限制。近年来， eDNA技术通过对水体、沉积物和生物膜等环境样品中的DNA进行扩增和高通量测序，实现生物群落组成的快速高效解析，目前已成为水生态监测的重要技术手段。

eDNA技术的生物多样性检测效果极大程度上取决于PCR通用引物的选择。由于不同引物的扩增性能存在差异，会直接影响生物群落组成的解析结果。因此，选择高性能PCR引物对eDNA生物多样性检测效果至关重要。理想的引物需要在目标类群中具有较高覆盖度，同时尽量减少非目标类群扩增，并具备足够的分类分辨率。目前针对藻类的eDNA引物评估多针对少数引物或特定类群（例如硅藻），尚缺乏对更广泛淡水真核藻类的系统性引物比较与评估，限制了eDNA技术在藻类监测中的标准化应用。

为填补上述空缺，本研究从pr2-primers数据库获取覆盖18S rRNA基因不同高变区的93对引物，使用计算机模拟PCR（in silico PCR）评估引物的理论扩增性能。研究发现，不同引物在in silico PCR中表现差异明显，部分排名靠前的引物可覆盖PR2数据库中约90%的藻类物种（图1）。

图1. 93对引物在in silico PCR中扩增藻类物种数量及其门水平分布。下方红色箭头表示用于实际扩增实验的35对引物。

根据in silico PCR结果选取表现优异、中等和较差的引物共35对，利用采自云南九大高原湖泊的真实eDNA样品进行扩增验证（in vitro PCR）。这些湖泊（包括滇池、洱海、抚仙湖、程海、泸沽湖、杞麓湖、异龙湖、星云湖和阳宗海）覆盖较广的地理位置、海拔和营养状态，能够代表多样的淡水生境。

在in vitro PCR评估中，共32对引物获得有效扩增结果。这些引物检测到的真核藻类mOTU数量差异明显，单个引物检测到的真核藻类mOTU数量从0到221不等（图2）。研究识别出若干在淡水真核藻类多样性检测中表现较好的候选引物，包括Pr_89（V8f/1510R）、Pr_90（TAReuk454FWD1/V4r）、Pr_99（A-528F/B-706R）、Pr_107（960F/NSR1438）和Pr_98（A-528F/V4RB）。这些引物在藻类多样性检测、分类覆盖和实际扩增表现方面具有较好的综合潜力。

图2. （a）32对引物扩增真实eDNA样品获得不同藻类类群序列组成比例。（b）检测到属于不同藻类门的mOTU数量。（c）藻类mOTU分配至不同分类层级的数量。

与in silico PCR结果相比，部分表现较好的引物在in vitro PCR中并未获得相应的检测效果（图3）；相反，一些在in silico PCR排名中等的引物在in vitro PCR中表现更优。这说明in silico PCR可作为引物筛选的初步参考，但不能完全替代真实环境样品中的实验验证。值得注意的是，一些目前在大规模国际监测项目中使用的引物（如1389F/1510R）表现欠佳，提示有必要针对特定研究区域进行引物性能的预实验评估。

图3. 不同引物的in silico PCR（上）和in vitro PCR（下）效果排名对比。各引物按检测到的藻类物种数/mOTU数由左至右依次递减排列。

研究还发现，无论是in silico PCR还是in vitro PCR结果，不同18S rRNA高变区对应引物的检测效果在多样性和分类分辨率方面无显著差异。表现较好的引物分别覆盖V4、V7及V8–V9等不同区域，说明引物性能不仅取决于目标片段位置，还可能受到引物序列匹配、扩增效率、非目标扩增、PCR条件以及环境样品组成等多种因素共同影响。

此外，研究比较PR2、SILVA和GenBank三个参考数据库在藻类分类注释中的表现。结果显示，经质控处理的PR2数据库能提供更优的真核藻类分类注释效果，整体表现优于SILVA和GenBank。这表明，除引物选择外，参考数据库质量也是影响eDNA监测结果准确性和可比性的关键因素。

该研究系统揭示淡水真核藻类eDNA通用引物在理论预测和实际应用中的差异，强调在开展大规模水生态监测前进行引物验证的重要性，并阐释参考数据库质量对eDNA分类注释结果和监测准确性的重要影响。研究结果为淡水真核藻类eDNA检测流程与水生态健康评价的标准化提供重要方法学依据。

论文第一作者为北京大学城市与环境学院博士罗源。闫姿伶、张思煜、刘凯参与了研究工作，通讯作者为姚蒙研究员。该研究得到国家杰出青年科学基金和云南省社会发展领域科技计划等项目的支持。原文链接：https://doi.org/10.1016/j.jenvman.2026.130006